文献分享--空间转录组学高分辨率绘制宿主-肠道微生物组生物地理分布图

作者Evil Genius生活总是坎坎坷坷一点都不顺不是这儿拌一下就是那儿磕破了。目前visium低精度发表的文章大约1500篇左右其中包括方法文而visium HD发表了大约30篇而且我看了visium HD文章大约20篇感觉还是和visium差异挺大的。首先最明显的感觉就是visium可以作为文章的主体部分但是visium HD目前还没有这样的文章很多分析的问题visium HD还没有彻底的解决。说起来分析分子niche、细胞niche邻域通讯等内容但是真正实施到visium HD上仍然是困难重重到目前为止我经手了十几个HD的项目可以说客户的期待值是100真正落地连20都没有因为客户大多想以visium HD为主发表文章实际却是摸着石头过河全是坑。现在风气已经不太好了实验产品标准化交付钱货两清但是分析却无法做到这样大部分客户都以为给了钱就能做到文章的水准实际这才是科研的开始需要不断的探索试错底层的东西是无法标准化的需要我们花费大量的心思来思考来总结经验所以为发文章最好的两个阶段一是学生阶段一门心思学习新的技能探索提升认知发表高水平论文二就是编制内阶段无后顾之忧有试错的空间进行大量的总结最后研究明白所以说科研是一场马拉松我们需要具有科研精神的人需要长时间钻研课题的人而这种人据我的观察只有编制 兴趣才可能出现我之前的生信分析的领导大多数都不再做分析了因为并不挣钱例如周运来现在转行去做市场销售了只有转行才能还得起每月过万的房贷从我的现状来看放弃科研精神估计也是必然的。希望大家进入编制的过程中科研的兴趣还能保持。今天我们分享文献visium Stereo-seq 微生物。通过探索在空间RNA测序中利用酶促法对微生物RNA和宿主RNA进行原位加尾来绘制微生物组和宿主图谱。结果1、基于原位加尾技术的微生物组-宿主相互作用空间图谱构建核心方法研究团队利用一种结直肠癌小鼠模型APC缺陷在其肠道四个不同区域近端小肠、回肠、盲肠、结肠采集新鲜冷冻组织样本。他们在Visium空间转录组学平台上在标准流程之外创新性地引入了酶促原位加尾步骤。该步骤旨在增强对微生物RNA尤其是非聚腺苷酸化RNA的捕获效率。为评估其效果实验设置了未经原位加尾处理的对照组近端组织切片。通过测序每个样本平均获得1.56亿条读取序列每个捕获点约31,250条读取。关键发现与验证原位加尾显著增强微生物RNA捕获效率提升与对照组相比原位加尾技术使细菌RNA的捕获富集了高达99倍尤其改善了对低丰度类群如Tannerellaceae科、Eggerthellaceae科的检测。类群覆盖对大多数细菌类群的捕获均有提升同时保持了对宿主基因的高效捕获。病毒和古菌的RNA在近端小肠的捕获量也分别提高了10倍和6倍。结果验证将空间RNA-seq测得的微生物组成谱与批量宏转录组测序结果进行对比在微生物生物量高的盲肠和结肠区域显示出高度一致性验证了该方法的可靠性。在小肠区域一致性稍弱这可能归因于该区域生物量低、易产生假阳性以及微生物在亚毫米尺度上的高度空间异质性。原位加尾扩展了对宿主RNA的检测范围除了微生物RNA该方法还显著改善了对多种类型宿主RNA的捕获包括未剪接mRNA可能代表新生转录本、核糖体RNArRNA、微小RNAmiRNA、长链非编码RNAlncRNA等。这使得能够同时分析宿主细胞的动态响应和基因调控活动。识别出在不同肠道区域具有特异性空间表达模式的非编码RNA如回肠富集的lncRNA Gm16759调控T细胞分化、近端小肠的Gm31992以及盲肠和结肠的Gm56583和miR9-3hg与人类癌症相关。揭示了肠道微生物组的空间组织模式纵向梯度沿肠道长度从近端小肠/回肠到盲肠/结肠每个捕获点检测到的微生物分类单元属水平数量显著增加从平均14.1个增至114.4个。不同细菌科如乳杆菌科、毛螺菌科等的丰度随区域变化这与已知的肠道生态位分化相符。横向梯度从组织到肠腔通过将组织切片按距肠腔距离分仓分析发现不同细菌门如放线菌门、拟杆菌门、芽孢杆菌门在组织-黏液-肠腔轴线上呈现出偏好性分布。例如在小肠放线菌门和假单胞菌门更靠近组织/黏液层而拟杆菌门则更趋向于远离组织的肠腔区域。在盲肠和结肠芽孢杆菌门在所有区域占主导但拟杆菌门在组织层富集。结果2、高分辨率下解析微生物组-宿主互作图谱核心方法研究团队在Visium平台的基础上进一步采用了分辨率高达~0.5微米/像素的Stereo-seq平台并对Visium样本的相邻组织切片小鼠回肠等进行了分析。他们再次应用了原位加尾技术以同时捕获宿主和微生物RNA并结合成像数据与单细胞RNA测序数据将宿主基因表达精确定位到单个细胞类型。主要发现宿主基因表达的空间精细图谱编码基因宿主基因表达呈现显著的空间非均匀性。肠绒毛顶端的成熟肠细胞显示出更高水平和更多样化的基因表达。非编码与新生RNA原位加尾技术再次验证了其对非编码RNA和未剪接mRNA新生RNA捕获的显著提升。未剪接mRNA占宿主RNA的22.5%在隐窝基部富集可能与 transit amplifying 细胞的快速更新有关其中包含与结直肠癌相关的癌基因如Cdk8。区域特异性非编码RNA如6230400D17RiK在靠近肠壁的区域高表达而Ada基因则在绒毛顶端富集。免疫相关基因成功检测到参与微生物反应的基因空间分布如潘氏细胞隐窝基部表达的溶菌酶Lyz1和防御素以及固有层浆母细胞表达的IgA重链片段Igha。微生物组的微尺度空间组织密度与多样性观察到靠近宿主组织边界处细菌负荷和多样性较低。空间分布异质性不同菌属展现出截然不同的空间偏好。例如梭菌属Clostridium分布相对均匀克雷伯氏菌属Klebsiella富集于绒毛顶端而埃格特菌属Eggerthella则远离组织边界。菌落形成与大小分析发现54个菌属显示出显著的菌落形成空间自相关。通过Ripleys H分析估算出不同菌属的菌落大小差异显著乳杆菌属Lactobacillus菌落较小半径10微米Turicimonas属菌落中等~10微米而梭菌属菌落较大30微米。菌属间互作空间相关性分析揭示了不同菌属间的强关联例如Turicimonas和Sutterella在空间上共定位。沿肠道纵轴的微生物群结构变化高分辨率结果验证了低分辨率平台Visium的观察从近端小肠到结肠不同细菌门和科沿组织-肠腔轴线的分布模式具有区域特异性并与已知的肠道生物地理学一致如近端结肠中毛螺菌科和颤螺菌科富集于组织边界乳杆菌科和拟杆菌科则在肠腔更突出。菌落形成模式在不同肠道区域也有所不同回肠和远端区域能观察到清晰的乳杆菌、Turicibacter和梭菌菌落而近端小肠的菌落则更小。细菌基因表达的检测通过将微生物读数比对到丰度最高的六个物种的基因组成功检测到细菌的功能基因表达。例如与快速生长相关的groL基因、与糖代谢相关的ppdk、pckA和gap基因以及看家基因atpA这些信号主要源自肠腔。不同肠道区域细菌RNA的组成rRNA、tRNA、mRNA也存在差异为理解细菌在原位的生长和功能状态提供了线索。物种-面积关系SAR首次在肠道微生物组中量化了物种-面积关系。研究发现观察到的菌属数量与取样面积在从16 µm² 到 0.16 mm²的三个数量级范围内遵循幂律分布其幂指数0.47相对较高表明小鼠回肠微生物组具有较高的空间分散性这与动植物生态系统中的观察结果一致。结果3、肿瘤相关微生物组空间重构重点比较了肿瘤边缘区域与正常组织区域在宿主细胞和微生物空间组织上的差异。微生物的空间分布发生剧变正常组织微生物的最大密度区域位于距离宿主绒毛100-200微米处即微生物与组织之间存在一个无/低微生物的间隙。肿瘤组织微生物的最大密度区域直接位于肿瘤组织的边界处微生物与肿瘤细胞紧密接触。特定菌属向肿瘤边缘富集丰度最高的梭菌属Clostridium以及乳杆菌属Lactobacillus和副拟杆菌属Parabacteroides在肿瘤边缘显著富集与肿瘤组织紧密关联。而在正常组织中这些菌属则远离组织边界。乳杆菌属和Turicimonas在肿瘤区域依然表现出菌落形成的特征半径约10-20微米。宿主细胞类型的空间重排正常组织最接近宿主-微生物边界的细胞是成熟肠上皮细胞其后是未成熟肠上皮细胞。潘氏细胞位于隐窝基部符合预期的组织结构。肿瘤组织肿瘤区域富集了肿瘤相关的 transit amplifying 细胞以及多种免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和CD8 T细胞。而负责产生黏液的杯状细胞则因肿瘤块的挤压而远离组织-微生物边界。基因表达水平的变化在肿瘤亚区域部分基因包括癌症相关基因 Pkm的表达位置向肠腔方向移动提示肿瘤可能改变了宿主细胞的基因表达程序及其空间定位。观察结果的验证与延伸相邻回肠切片的额外数据以及另一只独立小鼠的数据均验证了上述观察结果。此外数据还提示肿瘤与微生物的接近程度可能与肿瘤大小存在相关性。简单看一下方法生活很好有你更好。