背景目前大肠杆菌表达系统由于他具有高产量、低成本、成熟的技术、短周期和易于扩展生产的特点他仍然是首选的表达系统。但是大肠杆菌表达系统存在形成不正确的折叠或不溶性包涵体的问题。尽管目前各种可溶性融合标签的帮助从细菌中生产大量可溶性蛋白质仍然是一个挑战。因此开发新的标签是必要的。抗冻蛋白AFP具有优异的可溶性和亲水性但目前没有关于将其用作可溶性融合标签的报告。此外也没有使用反向蛋白质反向序列作为可溶性融合标签的先例。抗冻蛋白通常包含Thr和Ser可以与水分子形成氢键以提供冰结合位点以发挥其热滞后活性和其他功能。2022年4月2日中国科学院国家结构化学重点实验室研究团队在Microb Cell Fact上发表了一篇名为“Retro-protein XXA is a remarkable solubilizing fusion tag for inclusion bodies”的研究他们选择了来源于小球藻的抗冻蛋白AXX并通过合成XXA基因获得了其反向蛋白质XXA以开发一种新的可溶性融合标签。研究发现XXA不仅比常见的可溶性融合标签有更强的效果还能改善各种包涵体。大多数经过测试的包涵体在去除XXA标签后仍可被纯化并保持溶解状态。XXA和AXX特性及溶解效果的比较当表达并融合XXA时Chrono115-306、Notch2NL1-210和NusA以可溶形式存在于上清液中。这些数据表明XXA能显著促进这三种包涵体蛋白的可溶性表达且XXA的溶解效果比GST、Trx和NusA更强。然而AXX-Chrono115-306融合蛋白没有表达。通过对AXX和XXA的二级结构和三级结构预测发现这2个蛋白都是由长的α-螺旋组成XXA和AXX在溶液中具有相同的聚集状态而它们都是有限的寡聚体而不是单体或无序的高聚物。通过热稳定性分析发现XXA和AXX具有较高的热稳定性Tm值几乎相同但是XXA的降解速度低于AXX。说明XXA比AXX具有更好的稳定性和表达率。XXA可能是一种在低温和高温下都能促进融合的标签通过在低温16℃和高温25℃诱导表达带有SUMOMBP和XXA标签的蛋白NbALFA和CUA63106发现XXA不管是在16℃还是25℃下都可以促进蛋白可溶性表达。XXA位于N端或C端都可能促进异源蛋白的可溶性表达将bdNEDP1单独表达大多数蛋白质位于沉淀物中。当XXA位于N端并与bdNEDP1融合时大多数重组蛋白以可溶形式表达。即使将XXA放置在C端产物仍然分布在上清液中。这些发现表明XXA作为一种融合标签不仅可以促进bdNEDP1的可溶性表达而且无论位于N端还是C端都能表现出其效果。XXA和其他标签对异源蛋白可溶性表达效果的多重比较将Notch2NL1-210和nClu分别与Sumo、Trx、GST、XXA、MBP和NusA融合并确定它们与每个融合蛋白的溶解性。结果表明Sumo、Trx和MBP对Notch2NL1-210的可溶性效果较差大多数融合蛋白以沉淀形式存在而GST的效果稍微好一些。XXA和NusA的融合效果最好大多数融合蛋白以可溶形式表达。两种融合蛋白Sumo-nClu和Trx-nClu没有明显表达。同时GST和NusA对nClu的溶解效果较差大多数融合蛋白存在于沉淀中。XXA对nClu的溶解效果最好。XXA的序列只有192个氨基酸对目标蛋白的产量影响较小但比MBP和NusA有更强的可溶性效果。因此XXA有望真正实现同时增强可溶性表达和生产。经过与XXA融合处理后所测试的包涵体可以被提纯将包涵体表达的蛋白与XXA和His融合后使用Ni2树脂进行纯化表达于低温16°C的融合蛋白可以使用Ni2树脂纯化以获得纯样品。通过选择性蛋白酶TEV、sumo蛋白酶和HRV_3C切割XXA的融合蛋白所有融合蛋白都成功切割。这表明XXA不影响特定蛋白酶对融合蛋白的切割并且适合作为可溶性融合标签。同时目标蛋白在切割后保持可溶性且没有重新沉淀。所测试的包涵体与XXA结合后可能具有功能作用通过纯化融合蛋白XXA-bdNEDP1和XXA-NbALFA并使用酶消化和Western blot进行了测试发现他们在4℃和25℃下都具有酶学活性说明所测试的包涵体与XXA结合后可能具有功能作用。XXA溶解性的原理和优点XXAXA单体的C-末端一侧积累了大量的相同电荷而另一侧则是一个疏水区域。XXA寡聚物的结构显示疏水区域嵌入并形成聚合物的内核而相同电荷区域的侧链则分布在表面。包涵体与淀粉样结构的形成密切相关而淀粉样结构最初往往由蛋白质聚集引起。位于XXA寡聚体表面的大量相同电荷是增强蛋白质可溶性表达的关键因素。目标包涵体蛋白的聚集趋势被XXA寡聚体的强库仑排斥力所阻止。因此融合蛋白不能相互聚集。结果蛋白质结构不能形成因为目标蛋白的聚集被阻止目标蛋白可以在水相中正确折叠从而显著改善包涵体的可溶性表达。总结人工蛋白质XXA是一种反向蛋白质反向序列源自AFPAXX。它们的全长序列是192个氨基酸XXA和AXX都显示出增强包涵体可溶性表达的出色能力作为可溶性融合标签。然而XXA比AXX显示出更多的稳定性和更好的表达。XXA能够明显增强许多包涵体的可溶性表达并且溶解性优于其他标签通过与XXA标签融合获得的这些可溶性重组蛋白可以被纯化并且在去除XXA标签后仍然具有功能甚至仍然保持可溶性。氨基酸序列如下AXXMQDESLADKAKSAIETAKHAVSDAAQKVKETVTGAAADVQETARDVTQDQRQNLGYAEQKAADTLGDVKAAAQEAYESAKQRASEAAEGAKSTASELGGSAERAVRDAAGGAEGAGRDAQGAAREGLKGAEGAGATDEARRHAEDVADTAKEKYSELKGDAKEGLGRAQAKGEDLAGDASKAAQDAADRLKPXXAPKLRDAADQAAKSADGALDEGKAQARGLGEKADGKLESYKEKATDAVDEAHRRAEDTAGAGEAGKLGERAAGQADRGAGEAGGAADRVAREASGGLESATSKAGEAAESARQKASEYAEQAAAKVDGLTDAAKQEAYGLNQRQDQTVDRATEQVDAAAGTVTEKVKQAADSVAHKATEIASKAKDALSEDQM
文献分享：一种显著的反向蛋白质促溶标签
背景目前大肠杆菌表达系统由于他具有高产量、低成本、成熟的技术、短周期和易于扩展生产的特点他仍然是首选的表达系统。但是大肠杆菌表达系统存在形成不正确的折叠或不溶性包涵体的问题。尽管目前各种可溶性融合标签的帮助从细菌中生产大量可溶性蛋白质仍然是一个挑战。因此开发新的标签是必要的。抗冻蛋白AFP具有优异的可溶性和亲水性但目前没有关于将其用作可溶性融合标签的报告。此外也没有使用反向蛋白质反向序列作为可溶性融合标签的先例。抗冻蛋白通常包含Thr和Ser可以与水分子形成氢键以提供冰结合位点以发挥其热滞后活性和其他功能。2022年4月2日中国科学院国家结构化学重点实验室研究团队在Microb Cell Fact上发表了一篇名为“Retro-protein XXA is a remarkable solubilizing fusion tag for inclusion bodies”的研究他们选择了来源于小球藻的抗冻蛋白AXX并通过合成XXA基因获得了其反向蛋白质XXA以开发一种新的可溶性融合标签。研究发现XXA不仅比常见的可溶性融合标签有更强的效果还能改善各种包涵体。大多数经过测试的包涵体在去除XXA标签后仍可被纯化并保持溶解状态。XXA和AXX特性及溶解效果的比较当表达并融合XXA时Chrono115-306、Notch2NL1-210和NusA以可溶形式存在于上清液中。这些数据表明XXA能显著促进这三种包涵体蛋白的可溶性表达且XXA的溶解效果比GST、Trx和NusA更强。然而AXX-Chrono115-306融合蛋白没有表达。通过对AXX和XXA的二级结构和三级结构预测发现这2个蛋白都是由长的α-螺旋组成XXA和AXX在溶液中具有相同的聚集状态而它们都是有限的寡聚体而不是单体或无序的高聚物。通过热稳定性分析发现XXA和AXX具有较高的热稳定性Tm值几乎相同但是XXA的降解速度低于AXX。说明XXA比AXX具有更好的稳定性和表达率。XXA可能是一种在低温和高温下都能促进融合的标签通过在低温16℃和高温25℃诱导表达带有SUMOMBP和XXA标签的蛋白NbALFA和CUA63106发现XXA不管是在16℃还是25℃下都可以促进蛋白可溶性表达。XXA位于N端或C端都可能促进异源蛋白的可溶性表达将bdNEDP1单独表达大多数蛋白质位于沉淀物中。当XXA位于N端并与bdNEDP1融合时大多数重组蛋白以可溶形式表达。即使将XXA放置在C端产物仍然分布在上清液中。这些发现表明XXA作为一种融合标签不仅可以促进bdNEDP1的可溶性表达而且无论位于N端还是C端都能表现出其效果。XXA和其他标签对异源蛋白可溶性表达效果的多重比较将Notch2NL1-210和nClu分别与Sumo、Trx、GST、XXA、MBP和NusA融合并确定它们与每个融合蛋白的溶解性。结果表明Sumo、Trx和MBP对Notch2NL1-210的可溶性效果较差大多数融合蛋白以沉淀形式存在而GST的效果稍微好一些。XXA和NusA的融合效果最好大多数融合蛋白以可溶形式表达。两种融合蛋白Sumo-nClu和Trx-nClu没有明显表达。同时GST和NusA对nClu的溶解效果较差大多数融合蛋白存在于沉淀中。XXA对nClu的溶解效果最好。XXA的序列只有192个氨基酸对目标蛋白的产量影响较小但比MBP和NusA有更强的可溶性效果。因此XXA有望真正实现同时增强可溶性表达和生产。经过与XXA融合处理后所测试的包涵体可以被提纯将包涵体表达的蛋白与XXA和His融合后使用Ni2树脂进行纯化表达于低温16°C的融合蛋白可以使用Ni2树脂纯化以获得纯样品。通过选择性蛋白酶TEV、sumo蛋白酶和HRV_3C切割XXA的融合蛋白所有融合蛋白都成功切割。这表明XXA不影响特定蛋白酶对融合蛋白的切割并且适合作为可溶性融合标签。同时目标蛋白在切割后保持可溶性且没有重新沉淀。所测试的包涵体与XXA结合后可能具有功能作用通过纯化融合蛋白XXA-bdNEDP1和XXA-NbALFA并使用酶消化和Western blot进行了测试发现他们在4℃和25℃下都具有酶学活性说明所测试的包涵体与XXA结合后可能具有功能作用。XXA溶解性的原理和优点XXAXA单体的C-末端一侧积累了大量的相同电荷而另一侧则是一个疏水区域。XXA寡聚物的结构显示疏水区域嵌入并形成聚合物的内核而相同电荷区域的侧链则分布在表面。包涵体与淀粉样结构的形成密切相关而淀粉样结构最初往往由蛋白质聚集引起。位于XXA寡聚体表面的大量相同电荷是增强蛋白质可溶性表达的关键因素。目标包涵体蛋白的聚集趋势被XXA寡聚体的强库仑排斥力所阻止。因此融合蛋白不能相互聚集。结果蛋白质结构不能形成因为目标蛋白的聚集被阻止目标蛋白可以在水相中正确折叠从而显著改善包涵体的可溶性表达。总结人工蛋白质XXA是一种反向蛋白质反向序列源自AFPAXX。它们的全长序列是192个氨基酸XXA和AXX都显示出增强包涵体可溶性表达的出色能力作为可溶性融合标签。然而XXA比AXX显示出更多的稳定性和更好的表达。XXA能够明显增强许多包涵体的可溶性表达并且溶解性优于其他标签通过与XXA标签融合获得的这些可溶性重组蛋白可以被纯化并且在去除XXA标签后仍然具有功能甚至仍然保持可溶性。氨基酸序列如下AXXMQDESLADKAKSAIETAKHAVSDAAQKVKETVTGAAADVQETARDVTQDQRQNLGYAEQKAADTLGDVKAAAQEAYESAKQRASEAAEGAKSTASELGGSAERAVRDAAGGAEGAGRDAQGAAREGLKGAEGAGATDEARRHAEDVADTAKEKYSELKGDAKEGLGRAQAKGEDLAGDASKAAQDAADRLKPXXAPKLRDAADQAAKSADGALDEGKAQARGLGEKADGKLESYKEKATDAVDEAHRRAEDTAGAGEAGKLGERAAGQADRGAGEAGGAADRVAREASGGLESATSKAGEAAESARQKASEYAEQAAAKVDGLTDAAKQEAYGLNQRQDQTVDRATEQVDAAAGTVTEKVKQAADSVAHKATEIASKAKDALSEDQM
