摘要转录因子由于结构复杂、易错误折叠、表达得率低等特点一直是蛋白表达领域中的技术难点。本文基于Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统的实际研究案例介绍复杂转录因子TF L的表达优化、结构域筛选、可溶性标签优化以及DNA结合功能验证流程展示无细胞蛋白表达技术在复杂蛋白快速制备中的应用价值。关键词无细胞蛋白表达、CFPS、转录因子表达、eProtein Discovery、复杂蛋白表达、数字微流控、DNA结合实验、EMSA、功能蛋白制备、Nuclera一、复杂转录因子表达为何一直具有挑战性转录因子TFs是调控细胞命运、发育以及信号通路的重要蛋白也被称为细胞中的“主控调节因子”。其中转录因子LTF L在神经分化、造血以及器官发生过程中具有重要作用同时对于干细胞多能性维持、中枢神经系统发育以及眼部组织形成也具有关键意义。当TF L发生异常时还可能与部分发育障碍相关因此近年来逐渐成为潜在治疗靶点。然而这类复杂转录因子的表达与纯化长期以来都存在明显技术难题。TF L同时包含LIM结构域、同源结构域以及内在无序区域在传统大肠杆菌表达系统中非常容易形成包涵体即使完成复性其功能性蛋白得率依然较低。同时在昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母表达系统中也常出现表达量不足、蛋白降解严重以及纯化复杂等问题。这些因素都会直接影响后续结构研究、功能验证以及药物筛选工作。因此如何快速获得高质量、可溶性且具有功能活性的复杂转录因子蛋白已经成为当前蛋白研究领域的重要方向。二、Nuclera无细胞蛋白表达系统简介本研究采用Nuclera公司的eProtein Discovery系统进行复杂转录因子表达与优化。该系统基于数字微流控技术与无细胞蛋白表达技术可在较短时间内自动完成多种DNA构建体以及无细胞混合体系的筛选工作从而快速找到更适合目标蛋白表达与纯化的条件组合。eProtein Discovery系统能够在24小时内生成192组表达数据以及30组纯化数据并进一步完成表达条件优化。研究人员仅需48小时即可完成从DNA到可直接用于实验的可溶性蛋白制备流程大幅缩短传统蛋白表达优化周期。图1eProtein Discovery系统流程图48小时内完成从DNA到可直接用于实验的蛋白制备关于Nuclera无细胞蛋白表达平台更多技术资料也可参考https://www.mine-bio.com/nuclera/?utm_sourcecsdnutm_mediumreferralutm_campaignnuclera_article三、复杂转录因子TF L的无细胞蛋白表达策略本研究中研究人员首先利用eProtein Discovery系统对TF L不同变体进行表达筛选包括全长蛋白、未知功能结构域L2以及DNA结合结构域L3。研究过程中借助AlphaFold结构预测工具对不同功能区域进行分析与拆分从而构建不同eGene表达载体。在完成密码子优化后研究人员进一步在构建体两端加入3C和TEV序列同时针对不同构建体设计了多种可溶性标签以提高复杂蛋白的表达稳定性与可溶性。图2TF L变体的AlphaFold结构预测随后研究人员构建了24个eGene构建体并同时搭配不同无细胞混合体系进行筛选。所有构建体均在C端携带Strep-tag标签用于后续磁珠纯化以及表达定量分析。图3eGene构建体与无细胞混合体系筛选在无细胞混合体系方面本研究引入了Zn²⁺、分子伴侣DnaK、二硫键促进剂PDI/GSSG等组分。由于TF L含有两个富含半胱氨酸的LIM结构域因此Zn²⁺对于维持蛋白结构稳定性具有重要作用。同时通过氧化还原环境优化也能够进一步减少蛋白错误折叠与聚集。借助eProtein Discovery系统自动化筛选功能研究人员最终完成192组表达条件分析并自动筛选出最适合后续纯化与放大生产的表达方案。四、无细胞蛋白表达系统如何优化复杂蛋白表达研究结果显示eProtein Discovery系统在复杂转录因子表达过程中表现出较高效率。通过快速筛选不同标签与无细胞混合体系组合研究人员能够明显提升TF L不同变体的表达水平与纯化效果。实验发现在筛选得到的Top30表达条件中所有高表达构建体均含有可溶性标签。其中全长TF L与L2变体更适合使用P17标签而L3则更适合CUSF标签。与无标签构建体相比蛋白表达量提升约1.83倍。此外无细胞混合体系中的Zn²⁺、GSSG以及PDI⁺/GSSG组合也进一步提高了表达效率。研究发现氧化环境对于维持TF L结构完整性具有重要意义可有效减少异常聚集并帮助正确形成蛋白结构。图4TF L变体表达与纯化结果随后研究人员对优化后的表达体系进行过夜放大培养并成功获得微克级目标蛋白。SDS-PAGE分析结果显示洗脱泳道中出现了与理论分子量一致的目标条带说明蛋白已成功表达并完成纯化。图5eProtein Discovery系统放大生产结果Western blot进一步验证了Strep-tag标签完整存在也说明目标蛋白已成功合成。五、DNA结合实验验证蛋白功能活性为了验证无细胞蛋白表达系统制备得到的TF L蛋白是否仍保留天然功能研究人员进一步开展DNA结合EMSA实验。实验中研究人员使用Atto 488标记的双链DNA探针与不同TF L变体共同孵育并通过天然凝胶观察DNA迁移率变化情况。结果显示全长TF L能够与含其结合位点的DNA探针发生浓度依赖性结合同时形成明显DNA-蛋白复合物迁移带。此外L3结构域同样能够与DNA发生结合而含突变结合位点的阴性对照则未观察到明显结合现象这进一步证明了相互作用的特异性。图6DNA结合EMSA实验结果值得注意的是L2结构域并未表现出明显DNA结合能力这提示其可能在TF L中承担其他结构或调控功能而不仅仅参与DNA识别。六、总结本研究展示了Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统在复杂转录因子研究中的应用价值。相比传统细胞表达系统容易出现蛋白错误折叠、表达量低以及纯化困难等问题eProtein Discovery能够借助数字微流控技术快速筛选表达条件并在48小时内完成从DNA到功能性蛋白的制备流程。通过可溶性标签优化、无细胞混合体系筛选以及功能验证实验研究人员成功获得了具有DNA结合活性的TF L蛋白为后续结构研究、药物开发以及复杂蛋白功能研究提供了新的技术方案。对于复杂蛋白、难表达蛋白以及需要快速功能验证的研究方向而言无细胞蛋白表达平台正在逐渐成为重要工具之一。关于技术来源本文基于无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、cell-free system、转录因子制备解决方案等相关公开科研资料、参考文献、应用文章等曼博生物整理用于科研技术交流和实验、研发参考。
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摘要转录因子由于结构复杂、易错误折叠、表达得率低等特点一直是蛋白表达领域中的技术难点。本文基于Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统的实际研究案例介绍复杂转录因子TF L的表达优化、结构域筛选、可溶性标签优化以及DNA结合功能验证流程展示无细胞蛋白表达技术在复杂蛋白快速制备中的应用价值。关键词无细胞蛋白表达、CFPS、转录因子表达、eProtein Discovery、复杂蛋白表达、数字微流控、DNA结合实验、EMSA、功能蛋白制备、Nuclera一、复杂转录因子表达为何一直具有挑战性转录因子TFs是调控细胞命运、发育以及信号通路的重要蛋白也被称为细胞中的“主控调节因子”。其中转录因子LTF L在神经分化、造血以及器官发生过程中具有重要作用同时对于干细胞多能性维持、中枢神经系统发育以及眼部组织形成也具有关键意义。当TF L发生异常时还可能与部分发育障碍相关因此近年来逐渐成为潜在治疗靶点。然而这类复杂转录因子的表达与纯化长期以来都存在明显技术难题。TF L同时包含LIM结构域、同源结构域以及内在无序区域在传统大肠杆菌表达系统中非常容易形成包涵体即使完成复性其功能性蛋白得率依然较低。同时在昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母表达系统中也常出现表达量不足、蛋白降解严重以及纯化复杂等问题。这些因素都会直接影响后续结构研究、功能验证以及药物筛选工作。因此如何快速获得高质量、可溶性且具有功能活性的复杂转录因子蛋白已经成为当前蛋白研究领域的重要方向。二、Nuclera无细胞蛋白表达系统简介本研究采用Nuclera公司的eProtein Discovery系统进行复杂转录因子表达与优化。该系统基于数字微流控技术与无细胞蛋白表达技术可在较短时间内自动完成多种DNA构建体以及无细胞混合体系的筛选工作从而快速找到更适合目标蛋白表达与纯化的条件组合。eProtein Discovery系统能够在24小时内生成192组表达数据以及30组纯化数据并进一步完成表达条件优化。研究人员仅需48小时即可完成从DNA到可直接用于实验的可溶性蛋白制备流程大幅缩短传统蛋白表达优化周期。图1eProtein Discovery系统流程图48小时内完成从DNA到可直接用于实验的蛋白制备关于Nuclera无细胞蛋白表达平台更多技术资料也可参考https://www.mine-bio.com/nuclera/?utm_sourcecsdnutm_mediumreferralutm_campaignnuclera_article三、复杂转录因子TF L的无细胞蛋白表达策略本研究中研究人员首先利用eProtein Discovery系统对TF L不同变体进行表达筛选包括全长蛋白、未知功能结构域L2以及DNA结合结构域L3。研究过程中借助AlphaFold结构预测工具对不同功能区域进行分析与拆分从而构建不同eGene表达载体。在完成密码子优化后研究人员进一步在构建体两端加入3C和TEV序列同时针对不同构建体设计了多种可溶性标签以提高复杂蛋白的表达稳定性与可溶性。图2TF L变体的AlphaFold结构预测随后研究人员构建了24个eGene构建体并同时搭配不同无细胞混合体系进行筛选。所有构建体均在C端携带Strep-tag标签用于后续磁珠纯化以及表达定量分析。图3eGene构建体与无细胞混合体系筛选在无细胞混合体系方面本研究引入了Zn²⁺、分子伴侣DnaK、二硫键促进剂PDI/GSSG等组分。由于TF L含有两个富含半胱氨酸的LIM结构域因此Zn²⁺对于维持蛋白结构稳定性具有重要作用。同时通过氧化还原环境优化也能够进一步减少蛋白错误折叠与聚集。借助eProtein Discovery系统自动化筛选功能研究人员最终完成192组表达条件分析并自动筛选出最适合后续纯化与放大生产的表达方案。四、无细胞蛋白表达系统如何优化复杂蛋白表达研究结果显示eProtein Discovery系统在复杂转录因子表达过程中表现出较高效率。通过快速筛选不同标签与无细胞混合体系组合研究人员能够明显提升TF L不同变体的表达水平与纯化效果。实验发现在筛选得到的Top30表达条件中所有高表达构建体均含有可溶性标签。其中全长TF L与L2变体更适合使用P17标签而L3则更适合CUSF标签。与无标签构建体相比蛋白表达量提升约1.83倍。此外无细胞混合体系中的Zn²⁺、GSSG以及PDI⁺/GSSG组合也进一步提高了表达效率。研究发现氧化环境对于维持TF L结构完整性具有重要意义可有效减少异常聚集并帮助正确形成蛋白结构。图4TF L变体表达与纯化结果随后研究人员对优化后的表达体系进行过夜放大培养并成功获得微克级目标蛋白。SDS-PAGE分析结果显示洗脱泳道中出现了与理论分子量一致的目标条带说明蛋白已成功表达并完成纯化。图5eProtein Discovery系统放大生产结果Western blot进一步验证了Strep-tag标签完整存在也说明目标蛋白已成功合成。五、DNA结合实验验证蛋白功能活性为了验证无细胞蛋白表达系统制备得到的TF L蛋白是否仍保留天然功能研究人员进一步开展DNA结合EMSA实验。实验中研究人员使用Atto 488标记的双链DNA探针与不同TF L变体共同孵育并通过天然凝胶观察DNA迁移率变化情况。结果显示全长TF L能够与含其结合位点的DNA探针发生浓度依赖性结合同时形成明显DNA-蛋白复合物迁移带。此外L3结构域同样能够与DNA发生结合而含突变结合位点的阴性对照则未观察到明显结合现象这进一步证明了相互作用的特异性。图6DNA结合EMSA实验结果值得注意的是L2结构域并未表现出明显DNA结合能力这提示其可能在TF L中承担其他结构或调控功能而不仅仅参与DNA识别。六、总结本研究展示了Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统在复杂转录因子研究中的应用价值。相比传统细胞表达系统容易出现蛋白错误折叠、表达量低以及纯化困难等问题eProtein Discovery能够借助数字微流控技术快速筛选表达条件并在48小时内完成从DNA到功能性蛋白的制备流程。通过可溶性标签优化、无细胞混合体系筛选以及功能验证实验研究人员成功获得了具有DNA结合活性的TF L蛋白为后续结构研究、药物开发以及复杂蛋白功能研究提供了新的技术方案。对于复杂蛋白、难表达蛋白以及需要快速功能验证的研究方向而言无细胞蛋白表达平台正在逐渐成为重要工具之一。关于技术来源本文基于无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、cell-free system、转录因子制备解决方案等相关公开科研资料、参考文献、应用文章等曼博生物整理用于科研技术交流和实验、研发参考。
