大鼠髓核细胞(NPC)的分离、培养和鉴定protocol 云克隆原代细胞系列

大鼠髓核细胞(NPC)原代细胞 Primary Rat Nucleus Pulposus Cells (NPC)髓核原代细胞是从腰椎 / 尾椎椎间盘髓核组织直接分离、未经传代的初代软骨样细胞。因新鲜时呈半透明具有较强的抗压性属于类软骨细胞是维持椎间盘生理结构与力学功能的核心细胞。二、材料1、实验动物3-4周龄左右的SD大鼠3只雌雄不限2、组织来源椎间盘内的髓核3、手术器材手术剪镊、解剖镊、眼科剪镊4、消化酶Ⅱ型胶原酶5、培养基 DMEM/F1210%FBS1%双抗 5ng/mlEGF50nmol氢化可的松①DMEM/F12GibcoCat#: 51500056②EGF(Cloud-CloneCat#:APA560HU02③氢化可的松aladdinCat#: H110523三、实验步骤1. 取SD大鼠采用颈椎脱臼法处死全身于75酒精中浸泡3-5min。2. 用手术剪和解剖镊去除肌肉筋膜等组织再用加双抗的PBS漂洗几次取出椎间盘放入加双抗的PBS中漂洗几次。3.取出椎间盘用刀片沿中间划开取出半透明的髓核。4. 用眼科剪沿剪碎1-2mm³适量0.15% Ⅱ型胶原酶4℃过夜消化。5. 第二天取出直接终止消化1200rpm 离心5min铺板。6. 去上清加入完全培养基DMEM/F1210%FBS1%双抗5ng/mlEGF50nmol氢化可的松重悬7.2d后换液10d后细胞密度达到80%左右可以进行传代或冻存。四、各阶段的细胞照片图1P0 100X图2 (P2 100X五. 免疫荧光鉴定六. 常见问题武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠兔犬猫山羊豚鼠等540多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务