【一手数据】犬髓核细胞(NPC)原代细胞Primary Canine Nucleus Pulposus Cells 分离培养和鉴定

犬髓核细胞(NPC)原代细胞 Primary Canine Nucleus Pulposus Cells (NPC)品系beagle Dog比格犬组织来源椎间盘髓核鉴定II型胶原Collagen II免疫荧光染色聚集蛋白聚糖Aggrecan免疫荧光染色等阳性率纯度90%说一说分离和培养方案一椎间盘取材 将犬只仰卧位固定暴露腹主动脉旁脊柱通常取L1-L4或L5-L7段。用咬骨钳小心咬除椎体前缘骨皮质显露椎间盘及髓核腔隙。 用精细眼科镊和刀片小心分离椎间盘纤维环可见中央半透明胶冻样髓核组织正常犬髓核呈乳白色或淡黄色质地粘稠。以无菌镊夹取髓核组织块每个椎间盘约2050 mg置于含双抗PBS的50 mL离心管中。二组织预处理和酶联合消化 将髓核组织在含双抗PBS中漂洗23次用眼科剪小心剔除附着的软骨终板及纤维环组织。 将清洗干净的髓核组织转移至新的培养皿中剪成约1 mm³的小组织块。 将剪碎的髓核组织转移至50 mL离心管中加入510倍体积的0.1%0.2% II型胶原酶溶于无血清DMEM/F12培养基37℃水浴或恒温摇床中消化34小时每3040分钟轻轻摇晃一次。消化完成后将悬液通过70 μm细胞筛过滤去除未消化的组织残渣。 收集滤液1000 rpm离心58分钟弃上清。 用含10% FBS的完全培养基重悬细胞沉淀再次离心洗涤1次。三细胞接种和培养 弃上清用完全培养基重悬细胞沉淀细胞计数后以适当密度接种至T25培养瓶通常每个T25瓶接种12个椎间盘分离的细胞量。 于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养。 细胞生长观察 接种后2448 h大部分细胞已贴壁细胞呈圆形或多边形。 接种后35 d细胞逐渐伸展呈短梭形或三角形开始增殖形成小集落。 接种后710 d细胞集落逐渐扩大融合度可达70%80%此时可传代。Fig. Morphology of Canine Nucleus Pulposus Cells (×100)四、免疫荧光鉴定检测特征蛋白表达高表达标志物聚集蛋白聚糖 ACAN、Ⅱ 型胶原 COL2A1、PAX1、CD56 (NCAM)、波形蛋白 Vimentin、角蛋白 CK18Fig. Immunofluorescence identification of COL2A1 (×400)Fig. Immunofluorescence identification of Vimentin (×400)武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠兔犬猫山羊豚鼠等540多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。