一、提出问题毕赤酵母真核表达系统发酵上清液成分复杂包含菌体代谢杂蛋白、多糖、小分子多肽、无机盐等杂质直接使用粗提液无法满足体外活性评价标准。传统单一离子交换或分子筛纯化普遍存在两个痛点单一层析只能去除部分杂质最终产物纯度不足 75%纯化收率偏低大量目标蛋白在层析挂柱、洗脱环节流失经过真核表达系统获得的发酵原液白白损耗提高原料生产成本。针对 rD-M 融合蛋白理化特性等电点偏碱性、分子量约 12kDa需要组合两步层析技术搭建从粗上清到高纯蛋白的标准化纯化路线解决纯度与收率双向难题。二、分析问题杂质特性分化发酵杂蛋白分为阴离子型杂蛋白可被 Q 阴离子柱吸附、小分子杂肽分子量远低于 12kDa分子筛可分离单一层析无法同时去除两类杂质缓冲液体系适配pH、盐浓度变化会改变目的蛋白带电性直接影响 Q 柱挂柱效率进而降低真核表达系统产物纯化回收率分子筛参数Sephadex G-75 分子筛分离区间适配 3kDa~70kDa恰好适配 rD-M 分子量但若流速不合理蛋白峰与杂峰重叠分离效果下降。 基于以上理化分析确定「Q Sepharose HP 阴离子交换层析→Sephadex G-75 凝胶过滤层析」的两步串联纯化方案。三、解决问题双步层析实操方案第一步Q Sepharose HP 阴离子交换层析粗纯化平衡20mmol/L Tris-HClpH8.0缓冲液平衡层析柱 3 倍柱体积上样发酵上清过滤后匀速上柱同平衡液冲洗 3~5 柱体积去除流穿杂蛋白梯度洗脱含 1mol/L NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液线性洗脱收集蛋白洗脱峰SDS-PAGE 筛选含目标蛋白组分。第二步Sephadex G-75 分子筛精细纯化Q 柱富集样品浓缩后上样 G-75 凝胶柱磷酸钠缓冲液 1.0mL/min 匀速洗脱分段收集洗脱组分电泳筛选高纯目的蛋白冻干保存。 全程依托真核表达系统获得的标准化发酵原液做原料所有缓冲液、流速参数固定化保证工艺可重复。四、直观实验数据Q 柱粗纯结果粗上清经阴离子柱纯化后蛋白纯度由原液 12% 提升至 68%目标蛋白收率 65%G75 精细纯化数据分子筛二次纯化后终产物纯度95%整体工艺综合收率 43%重复性验证连续 3 批次真核表达系统发酵产物纯化最终纯度波动3%工艺稳定性达标 高纯冻干蛋白满足后续细胞水平活性筛选实验需求。文末参考文献朱文赫张巍徐俊杰等.rSalmosin-Mel 融合蛋白在毕赤酵母中表达及活性研究 [J]. 生物技术2017,27 (3):239-243.
卡梅德生物技术快报｜基于真核表达系统产物，双步层析法高效纯化 rD-M 融合蛋白工艺落地
一、提出问题毕赤酵母真核表达系统发酵上清液成分复杂包含菌体代谢杂蛋白、多糖、小分子多肽、无机盐等杂质直接使用粗提液无法满足体外活性评价标准。传统单一离子交换或分子筛纯化普遍存在两个痛点单一层析只能去除部分杂质最终产物纯度不足 75%纯化收率偏低大量目标蛋白在层析挂柱、洗脱环节流失经过真核表达系统获得的发酵原液白白损耗提高原料生产成本。针对 rD-M 融合蛋白理化特性等电点偏碱性、分子量约 12kDa需要组合两步层析技术搭建从粗上清到高纯蛋白的标准化纯化路线解决纯度与收率双向难题。二、分析问题杂质特性分化发酵杂蛋白分为阴离子型杂蛋白可被 Q 阴离子柱吸附、小分子杂肽分子量远低于 12kDa分子筛可分离单一层析无法同时去除两类杂质缓冲液体系适配pH、盐浓度变化会改变目的蛋白带电性直接影响 Q 柱挂柱效率进而降低真核表达系统产物纯化回收率分子筛参数Sephadex G-75 分子筛分离区间适配 3kDa~70kDa恰好适配 rD-M 分子量但若流速不合理蛋白峰与杂峰重叠分离效果下降。 基于以上理化分析确定「Q Sepharose HP 阴离子交换层析→Sephadex G-75 凝胶过滤层析」的两步串联纯化方案。三、解决问题双步层析实操方案第一步Q Sepharose HP 阴离子交换层析粗纯化平衡20mmol/L Tris-HClpH8.0缓冲液平衡层析柱 3 倍柱体积上样发酵上清过滤后匀速上柱同平衡液冲洗 3~5 柱体积去除流穿杂蛋白梯度洗脱含 1mol/L NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液线性洗脱收集蛋白洗脱峰SDS-PAGE 筛选含目标蛋白组分。第二步Sephadex G-75 分子筛精细纯化Q 柱富集样品浓缩后上样 G-75 凝胶柱磷酸钠缓冲液 1.0mL/min 匀速洗脱分段收集洗脱组分电泳筛选高纯目的蛋白冻干保存。 全程依托真核表达系统获得的标准化发酵原液做原料所有缓冲液、流速参数固定化保证工艺可重复。四、直观实验数据Q 柱粗纯结果粗上清经阴离子柱纯化后蛋白纯度由原液 12% 提升至 68%目标蛋白收率 65%G75 精细纯化数据分子筛二次纯化后终产物纯度95%整体工艺综合收率 43%重复性验证连续 3 批次真核表达系统发酵产物纯化最终纯度波动3%工艺稳定性达标 高纯冻干蛋白满足后续细胞水平活性筛选实验需求。文末参考文献朱文赫张巍徐俊杰等.rSalmosin-Mel 融合蛋白在毕赤酵母中表达及活性研究 [J]. 生物技术2017,27 (3):239-243.
