什么是蛋白-小分子化合物互作 简单说就是小分子化合物比如激素、药物、代谢物通过特定结构位点与蛋白质结合像钥匙插对锁一样激活或抑制蛋白功能。这种互作是生命活动调控的核心分子基础也是药物研发、功能基因组学等领域的关键研究方向。一、互作机理蛋白-小分子化合物互作本质是基于分子间非共价键氢键、疏水作用、范德华力、静电相互作用的特异性结合即小分子作为配体Ligand与蛋白靶点Target的活性位点结合诱导靶点构象改变进而调控其酶活性、信号传导或分子转运等功能。在蛋白 - 小分子化合物互作研究中关键筛选策略涵盖AI 多模态文库筛选、表面等离子体共振SPR、药物亲和反应靶向稳定性DARTS及小分子 - 蛋白质 Pull-down 技术后续互作验证则可通过表面等离子体共振SPR、微量热脉动技术MST、等温滴定量热ITC与细胞热迁移CETSA等技术实现。南京瑞源生物聚焦该领域需求提供从筛选到验证的蛋白 - 小分子化合物互作整体解决方案。二、互作筛选关键策略1.AI多模态文库筛选服务随着结构生物学与计算化学方法的成熟基于结构的虚拟筛选Virtual Screening, VS已成为小分子先导发现与分子优化的重要手段。通过分子对接在计算机上高通量评估配体与蛋白的结合模式以及相对亲和力能显著降低实验成本、提高筛选效率。小源采用Smina对外部提供或自建的化合物蛋白库进行两阶段虚拟筛选系统评估候选分子的结合模式与打分为后续的分子优化与功能验证提供依据。AI多模态文库筛选原理示意图2.表面等离子体共振SPR)除了上面提到的虚拟预测干实验湿实验也可以用来筛选蛋白-小分子化合物的互作。小源开发了基于Biacore平台的亲和力测定SPR技术当偏振光以临界角入射到金属薄膜常用金、银与介质的界面时光子能量会激发金属表面自由电子形成表面等离子体波。共振发生时入射光的大量能量被转移导致反射光强度显著减弱对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。SPR原理图3.药物亲和反应靶向稳定性DARTSSPR 技术依赖高质量纯化样品AI 筛选再精准也仅停留在预测层面而DARTS 技术恰好补上这一短板 —— 它能直接验证小分子与细胞内天然蛋白的结合活性且复杂样本中蛋白可保持天然互作状态更贴近生理实际场景。DARTS主要是一种非标记型的小分子药物靶点筛选与验证技术原理是当小分子药物与靶标蛋白特异性结合后能够改变蛋白自由能使靶标蛋白对广谱蛋白酶的水解作用产生更强抗性而未结合小分子药物的蛋白易被蛋白酶水解通过对比两组蛋白的水解差异就能筛选并鉴定出与小分子结合的靶标蛋白。4.小分子-蛋白质Pull-down技术小分子-蛋白质Pull-down技术主要是先通过化学修饰给活性小分子连接生物素等亲和标签制成小分子探针再把探针固定在链霉亲和素磁珠等固相支持物上作为 “诱饵”此时能与小分子特异性结合的靶蛋白会被探针捕获之后经过严格清洗去除非特异性结合的杂蛋白最后洗脱捕获到的靶蛋白通过 Western Blot 或质谱等技术鉴定蛋白“身份”。小分子-蛋白质Pull-down原理图三、精准验证互作真实性与功能性1.表面等离子体共振SPR)SPR技术除了可以用作筛选外也可用于验证。当偏振光以临界角入射到金属薄膜常用金、银与介质的界面时光子能量会激发金属表面自由电子形成表面等离子体波。共振发生时入射光的大量能量被转移导致反射光强度显著减弱对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。2.微量热泳动技术MST微量热泳动MicroScale ThermophoresisMST是一种基于热泳动现象的高灵敏度生物分析技术核心是用于定量检测溶液中分子间的相互作用。其原理是通过红外激光在毛细管样品中构建局部温度梯度荧光标记的目标分子如蛋白、核酸会在温度梯度中产生定向迁移热泳动当该分子与配体如小分子、另一蛋白结合形成复合物时会导致热泳动速率变化从而分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。微量热泳动技术MST原理图3.等温滴定量热ITC等温滴定量热Isothermal Titration CalorimetryITC是一种在恒温条件下通过精准检测分子结合过程中热量变化实现生物分子互作定量分析的核心技术。它可以直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量适用于研究蛋白、核酸、多肽、药物分子等的相互作用。等温滴定量热ITC原理图4.细胞热迁移技术CETSA在分子互作验证技术中细胞热迁移技术CETSA打破了传统体外技术如 SPR、ITC的局限无需纯化蛋白、无需修饰分子直接以完整细胞或组织为样本。当加热处理细胞时随着温度的升高蛋白质逐渐变性沉淀有活性的可溶性蛋白量逐渐减少。当细胞经药物处理后药物和靶蛋白结合使靶蛋白的热稳定性增强熔解温度Tm值增加根据药物处理前后Tm的变化情况确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。细胞热迁移技术CETSA原理图四、文献举例1.案例一以2025年发表的“Wogonin, a bioactive flavonoid from Scutellaria baicalensis, alleviates alcoholic pancreatitis via AMPK-mediated TFEB activation”为例。该研究为鉴定黄芩HQ的靶点对四种黄芩衍生的黄酮类化合物进行了虚拟筛选和分子对接。分子对接和Western印迹分析表明汉黄芩素Wogonin与AMPKAMP活化蛋白激酶强结合并促进AMPK磷酸化以增强TFEBEB转录因子的转录活性图1。为验证Wogonin-AMPK的直接相互作用等温滴定量热法ITC、表面等离子体共振SPR、细胞热迁移CETSA等实验证明汉黄芩素结合并增强的AMPK热稳定性。汉黄芩素恢复了AMPK和TFEB蛋白水平组织学分析显示酶原颗粒Zymogen Granules, ZG积累的显著减轻图2。总的来说汉黄芩素直接结合AMPK减轻酒精诱导的胰腺损伤和酶原颗粒ZG蓄积。研究确立汉黄芩素作为黄芩治疗功效背后的关键生物活性驱动因素协调AMPK-TFEB-自噬协调以减轻酒精性胰腺炎AP为开发植物源药物靶向TFEB以治疗胰腺炎提供了新的治疗策略。图1 对 HQ 组分与 TFEB 上游激酶进行分子对接分析。A. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷的化学结构B. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷分别与AMPKa26BX6、ERK24G6O和 mTOR4JT5的最优结合能量C. 葛根素分别与 AMPKa26BX6、ERK24G6O和 mTOR4JT5的最优结合模式D. 对接受HQ处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析E. 对p-AMPK和p-AMPK t-AMPK组合进行光密度分析F. 对接受葛根素处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析G. 对p-AMPK和p-AMPK t-AMPK组合进行光密度分析。图2 汉黄芩素Wogonin直接与 AMPK 相互作用从而减轻酒精性胰腺炎的病理症状。A - B. Wogonin 与 AMPK 之间相互作用的等温滴定热分析C. 表面等离子体共振SPR分析证实了Wogonin与 AMPK 之间具有高亲和力的结合D. Wogonin - AMPK 相互作用的细胞热迁移分析工作流程图E - F. 基于 CETSA 的Wogonin与 AMPK 相互作用的测定G. 对Wogonin处理过的小鼠的总胰腺裂解物进行了免疫印迹分析H. 对 AMPK 和 TFEB 进行了密度分析I. 用酒精和Wogonin处理的小鼠胰腺的代表性 HE 和甲苯胺蓝染色图像J. ZG 的面积被计数K. 测量血清淀粉酶。2.案例二以2025年发表的“Cyclovirobuxine D ameliorates cardiomyocyte senescence in diabetic cardiomyopathy mice by enhancing mitochondrial function via sirtuin 3–ATP5O signal axis”为例。研究通过免疫共沉淀、细胞热迁移CETSA以确定环维黄杨星DCVB-D与SIRT 3相互作用且CVB-D显著增加了SIRT 3在不同温度下的热稳定性。微量热泳动MST、表面等离子体共振SPR、等温滴定量热ITC实验结果表明SIRT 3直接与ATP 5O结合图3。最终得出结论CVB-D激活SIRT 3从而促进其去乙酰化功能进而增加去乙酰化ATP 5 O的水平从而延缓心肌细胞的衰老明确了CVB-D抑制心肌细胞衰老的分子机制这可能有助于促进研究缓解糖尿病心肌病DCM的进展。图3 CVB-D的保护作用取决于SIRT3对ATP5O的去乙酰化。A-B. SIRT3和ATP5O在心肌组织中的共定位免疫荧光图像C. 免疫沉淀分析表明用CVB-D预处理可抑制NMVMs中ATP5O的乙酰化n3D-E. NMVMs中SIRT3 和ATP5O共定位的免疫荧光图像比例尺20 微米F. 对用CVB-D或DMSO处理48小时的NMVMs进行CETSAn3G. CVB-D与SIRT3蛋白的分子对接H. CVB-D与SIRT3相互作用的MST分析I. SIRT3与ATP5O蛋白之间的分子对接J. 通过SPR测定SIRT3和ATP5O的结合亲和力K. 等温滴定量热法ITC测定表明SIRT3对ATP5O具有结合亲和力。五、应用✅1.新药研发与优化核心应用领域靶点验证确认小分子与疾病相关靶蛋白如肿瘤驱动蛋白、病毒酶的特异性结合验证该蛋白是否为药物作用的有效靶点。高通量药物筛选利用互作检测技术快速筛选化合物库找出能与靶蛋白高亲和力结合的潜在药物分子如从天然产物库中筛选抗癌小分子。药物耐药性研究探究耐药性突变蛋白与药物分子的互作变化如突变后结合力下降为设计新一代耐药性药物提供依据。✅2.基础生物学研究蛋白功能解析通过小分子化合物调控蛋白活性激活或抑制观察细胞或生物体的表型变化明确生理功能。酶学机制分析研究小分子底物、抑制剂、激活剂与酶的结合特性明确酶的催化机制、底物特异性及调控方式。✅3.农业与食品领域农药研发筛选能与害虫、病原菌关键蛋白如昆虫乙酰胆碱酯酶、真菌细胞壁合成酶结合的小分子开发高效、低毒的农药。食品添加剂研发优化食品中功能小分子与人体肠道蛋白、消化酶的互作提升营养吸收效率或改善风味。✅4.诊断试剂开发疾病标志物检测设计能与疾病特异性蛋白如肿瘤标志物、病毒蛋白高特异性结合的小分子探针开发快速诊断试剂。药物浓度监测利用小分子与药物结合蛋白的互作开发检测方法实时监测患者体内药物浓度指导精准用药。
揭示蛋白 - 化合物互作机制：AI 多模态筛选融合分子对接、CETSA 以及 SPR 为靶点研究赋能
什么是蛋白-小分子化合物互作 简单说就是小分子化合物比如激素、药物、代谢物通过特定结构位点与蛋白质结合像钥匙插对锁一样激活或抑制蛋白功能。这种互作是生命活动调控的核心分子基础也是药物研发、功能基因组学等领域的关键研究方向。一、互作机理蛋白-小分子化合物互作本质是基于分子间非共价键氢键、疏水作用、范德华力、静电相互作用的特异性结合即小分子作为配体Ligand与蛋白靶点Target的活性位点结合诱导靶点构象改变进而调控其酶活性、信号传导或分子转运等功能。在蛋白 - 小分子化合物互作研究中关键筛选策略涵盖AI 多模态文库筛选、表面等离子体共振SPR、药物亲和反应靶向稳定性DARTS及小分子 - 蛋白质 Pull-down 技术后续互作验证则可通过表面等离子体共振SPR、微量热脉动技术MST、等温滴定量热ITC与细胞热迁移CETSA等技术实现。南京瑞源生物聚焦该领域需求提供从筛选到验证的蛋白 - 小分子化合物互作整体解决方案。二、互作筛选关键策略1.AI多模态文库筛选服务随着结构生物学与计算化学方法的成熟基于结构的虚拟筛选Virtual Screening, VS已成为小分子先导发现与分子优化的重要手段。通过分子对接在计算机上高通量评估配体与蛋白的结合模式以及相对亲和力能显著降低实验成本、提高筛选效率。小源采用Smina对外部提供或自建的化合物蛋白库进行两阶段虚拟筛选系统评估候选分子的结合模式与打分为后续的分子优化与功能验证提供依据。AI多模态文库筛选原理示意图2.表面等离子体共振SPR)除了上面提到的虚拟预测干实验湿实验也可以用来筛选蛋白-小分子化合物的互作。小源开发了基于Biacore平台的亲和力测定SPR技术当偏振光以临界角入射到金属薄膜常用金、银与介质的界面时光子能量会激发金属表面自由电子形成表面等离子体波。共振发生时入射光的大量能量被转移导致反射光强度显著减弱对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。SPR原理图3.药物亲和反应靶向稳定性DARTSSPR 技术依赖高质量纯化样品AI 筛选再精准也仅停留在预测层面而DARTS 技术恰好补上这一短板 —— 它能直接验证小分子与细胞内天然蛋白的结合活性且复杂样本中蛋白可保持天然互作状态更贴近生理实际场景。DARTS主要是一种非标记型的小分子药物靶点筛选与验证技术原理是当小分子药物与靶标蛋白特异性结合后能够改变蛋白自由能使靶标蛋白对广谱蛋白酶的水解作用产生更强抗性而未结合小分子药物的蛋白易被蛋白酶水解通过对比两组蛋白的水解差异就能筛选并鉴定出与小分子结合的靶标蛋白。4.小分子-蛋白质Pull-down技术小分子-蛋白质Pull-down技术主要是先通过化学修饰给活性小分子连接生物素等亲和标签制成小分子探针再把探针固定在链霉亲和素磁珠等固相支持物上作为 “诱饵”此时能与小分子特异性结合的靶蛋白会被探针捕获之后经过严格清洗去除非特异性结合的杂蛋白最后洗脱捕获到的靶蛋白通过 Western Blot 或质谱等技术鉴定蛋白“身份”。小分子-蛋白质Pull-down原理图三、精准验证互作真实性与功能性1.表面等离子体共振SPR)SPR技术除了可以用作筛选外也可用于验证。当偏振光以临界角入射到金属薄膜常用金、银与介质的界面时光子能量会激发金属表面自由电子形成表面等离子体波。共振发生时入射光的大量能量被转移导致反射光强度显著减弱对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。2.微量热泳动技术MST微量热泳动MicroScale ThermophoresisMST是一种基于热泳动现象的高灵敏度生物分析技术核心是用于定量检测溶液中分子间的相互作用。其原理是通过红外激光在毛细管样品中构建局部温度梯度荧光标记的目标分子如蛋白、核酸会在温度梯度中产生定向迁移热泳动当该分子与配体如小分子、另一蛋白结合形成复合物时会导致热泳动速率变化从而分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。微量热泳动技术MST原理图3.等温滴定量热ITC等温滴定量热Isothermal Titration CalorimetryITC是一种在恒温条件下通过精准检测分子结合过程中热量变化实现生物分子互作定量分析的核心技术。它可以直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量适用于研究蛋白、核酸、多肽、药物分子等的相互作用。等温滴定量热ITC原理图4.细胞热迁移技术CETSA在分子互作验证技术中细胞热迁移技术CETSA打破了传统体外技术如 SPR、ITC的局限无需纯化蛋白、无需修饰分子直接以完整细胞或组织为样本。当加热处理细胞时随着温度的升高蛋白质逐渐变性沉淀有活性的可溶性蛋白量逐渐减少。当细胞经药物处理后药物和靶蛋白结合使靶蛋白的热稳定性增强熔解温度Tm值增加根据药物处理前后Tm的变化情况确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。细胞热迁移技术CETSA原理图四、文献举例1.案例一以2025年发表的“Wogonin, a bioactive flavonoid from Scutellaria baicalensis, alleviates alcoholic pancreatitis via AMPK-mediated TFEB activation”为例。该研究为鉴定黄芩HQ的靶点对四种黄芩衍生的黄酮类化合物进行了虚拟筛选和分子对接。分子对接和Western印迹分析表明汉黄芩素Wogonin与AMPKAMP活化蛋白激酶强结合并促进AMPK磷酸化以增强TFEBEB转录因子的转录活性图1。为验证Wogonin-AMPK的直接相互作用等温滴定量热法ITC、表面等离子体共振SPR、细胞热迁移CETSA等实验证明汉黄芩素结合并增强的AMPK热稳定性。汉黄芩素恢复了AMPK和TFEB蛋白水平组织学分析显示酶原颗粒Zymogen Granules, ZG积累的显著减轻图2。总的来说汉黄芩素直接结合AMPK减轻酒精诱导的胰腺损伤和酶原颗粒ZG蓄积。研究确立汉黄芩素作为黄芩治疗功效背后的关键生物活性驱动因素协调AMPK-TFEB-自噬协调以减轻酒精性胰腺炎AP为开发植物源药物靶向TFEB以治疗胰腺炎提供了新的治疗策略。图1 对 HQ 组分与 TFEB 上游激酶进行分子对接分析。A. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷的化学结构B. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷分别与AMPKa26BX6、ERK24G6O和 mTOR4JT5的最优结合能量C. 葛根素分别与 AMPKa26BX6、ERK24G6O和 mTOR4JT5的最优结合模式D. 对接受HQ处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析E. 对p-AMPK和p-AMPK t-AMPK组合进行光密度分析F. 对接受葛根素处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析G. 对p-AMPK和p-AMPK t-AMPK组合进行光密度分析。图2 汉黄芩素Wogonin直接与 AMPK 相互作用从而减轻酒精性胰腺炎的病理症状。A - B. Wogonin 与 AMPK 之间相互作用的等温滴定热分析C. 表面等离子体共振SPR分析证实了Wogonin与 AMPK 之间具有高亲和力的结合D. Wogonin - AMPK 相互作用的细胞热迁移分析工作流程图E - F. 基于 CETSA 的Wogonin与 AMPK 相互作用的测定G. 对Wogonin处理过的小鼠的总胰腺裂解物进行了免疫印迹分析H. 对 AMPK 和 TFEB 进行了密度分析I. 用酒精和Wogonin处理的小鼠胰腺的代表性 HE 和甲苯胺蓝染色图像J. ZG 的面积被计数K. 测量血清淀粉酶。2.案例二以2025年发表的“Cyclovirobuxine D ameliorates cardiomyocyte senescence in diabetic cardiomyopathy mice by enhancing mitochondrial function via sirtuin 3–ATP5O signal axis”为例。研究通过免疫共沉淀、细胞热迁移CETSA以确定环维黄杨星DCVB-D与SIRT 3相互作用且CVB-D显著增加了SIRT 3在不同温度下的热稳定性。微量热泳动MST、表面等离子体共振SPR、等温滴定量热ITC实验结果表明SIRT 3直接与ATP 5O结合图3。最终得出结论CVB-D激活SIRT 3从而促进其去乙酰化功能进而增加去乙酰化ATP 5 O的水平从而延缓心肌细胞的衰老明确了CVB-D抑制心肌细胞衰老的分子机制这可能有助于促进研究缓解糖尿病心肌病DCM的进展。图3 CVB-D的保护作用取决于SIRT3对ATP5O的去乙酰化。A-B. SIRT3和ATP5O在心肌组织中的共定位免疫荧光图像C. 免疫沉淀分析表明用CVB-D预处理可抑制NMVMs中ATP5O的乙酰化n3D-E. NMVMs中SIRT3 和ATP5O共定位的免疫荧光图像比例尺20 微米F. 对用CVB-D或DMSO处理48小时的NMVMs进行CETSAn3G. CVB-D与SIRT3蛋白的分子对接H. CVB-D与SIRT3相互作用的MST分析I. SIRT3与ATP5O蛋白之间的分子对接J. 通过SPR测定SIRT3和ATP5O的结合亲和力K. 等温滴定量热法ITC测定表明SIRT3对ATP5O具有结合亲和力。五、应用✅1.新药研发与优化核心应用领域靶点验证确认小分子与疾病相关靶蛋白如肿瘤驱动蛋白、病毒酶的特异性结合验证该蛋白是否为药物作用的有效靶点。高通量药物筛选利用互作检测技术快速筛选化合物库找出能与靶蛋白高亲和力结合的潜在药物分子如从天然产物库中筛选抗癌小分子。药物耐药性研究探究耐药性突变蛋白与药物分子的互作变化如突变后结合力下降为设计新一代耐药性药物提供依据。✅2.基础生物学研究蛋白功能解析通过小分子化合物调控蛋白活性激活或抑制观察细胞或生物体的表型变化明确生理功能。酶学机制分析研究小分子底物、抑制剂、激活剂与酶的结合特性明确酶的催化机制、底物特异性及调控方式。✅3.农业与食品领域农药研发筛选能与害虫、病原菌关键蛋白如昆虫乙酰胆碱酯酶、真菌细胞壁合成酶结合的小分子开发高效、低毒的农药。食品添加剂研发优化食品中功能小分子与人体肠道蛋白、消化酶的互作提升营养吸收效率或改善风味。✅4.诊断试剂开发疾病标志物检测设计能与疾病特异性蛋白如肿瘤标志物、病毒蛋白高特异性结合的小分子探针开发快速诊断试剂。药物浓度监测利用小分子与药物结合蛋白的互作开发检测方法实时监测患者体内药物浓度指导精准用药。
